شرکت دانش بنیان هوراطب فارمد

04 دی آماده‌سازی آنتی‌ژن HCP از سلول پستانداران

آماده‌سازی آنتی‌ژن HCP از سلول پستانداران، اولین گام ایجاد یک سلول پوچ (null) است. این سلول فاقد ژن بیان‌کننده محصول دارویی است. برای تهیه سلول پوچ دو روش وجود دارد. در روش اول می‌توان از سلول‌های غیرترانسفکت شده (مانند سلول‌های والد) استفاده کرد که با سلول‌های تولیدکننده محصول منشأ مشترک داشته باشند. در روش دوم می‌توان از سلول‌های ترانسفکت تقلیدی (Mock-transfected null cells) استفاده کرد. در این روش سلول‌ها با وکتور خالی (Mock vector) ترانسفکت شده و یک رده سلولی بدون ژن کدکننده محصول ایجاد می‌گردد. این روش در قدیم ترانسفکشن تقلیدی (Mock transfection) نام داشت.

مزیت اصلی سلول ترانسفکت شده تقلیدی این است که قادر به بیان یکسری مارکرهای انتخابی (مانند دی هیدرو فولات ردوکتاز یا گلوتامین سنتتاز) است که در نهایت سبب تولید آنتی‌بادی علیه مارکرهای انتخابی می‌گردد. مزیت دیگر این است که سلول‌های پوچ ترانسفکت تقلیدی مارکرهای انتخابی را بیان می‌کنند و ممکن است در شرایط کشت سلولی که شبیه به فرایند تولید است رشد کنند. استفاده از مجموعه‌ای از رده‌های سلولی ترانسفکت شده تقلیدی حداکثر تنوع ژنتیکی ممکن را امکان‌پذیر می‌کند و بنابراین بیشترین پتانسیل تولید یک جمعیت پروتئینی سلول میزبان (HCP) را می‌دهد. البته ممکن است که این تنوع از یک ران به ران بعدی متفاوت باشد. هر دو رویکرد (سلول ترانسفکت نشده و ترانسفکت شده تقلیدی) به طور رایج استفاده می‌شوند.

پس از ایجاد سلول‌های پوچ، آنتی‌ژن‌های HCP را در یک بیورآکتور، فلاسک کشت سلولی یا کیسه کشت سلولی تولید می‌کنند. برای این کار یک پلتفرم از پروسه کشت سلولی برای چندین محصول اعمال می‌شود. سپس، آنتی‌ژن‌های HCP تولید شده پردازش می‌شوند تا از طیف گسترده آنها اطمینان حاصل گردد. آنتی‌ژن‌های HCP ممکن است از طریق ترکیب چندین ران مختلف از سلول پوچ با شرایط کشت سلولی کمی متفاوت تولید شوند. به‌عنوان‌مثال ممکن است در یکی از ران‌ها جهت افزایش بقای سلول، کشت را به مدت طولانی‌تر در بیورآکتور انکوبه کنند. از این رویکرد جهت به‌دست‌آوردن طیف گسترده‌تر HCP استفاده می‌شود. آنتی سرم‌های ایجاد شده علیه این ایمونوژن ممکن است برای تشخیص HCP در محصولات تولید شده از انواع فرایندهای متفاوت مناسب باشد.

این معرف‌ها همچنین ممکن است استحکام ایمونواسی HCP را نسبت به تغییرات فرایند افزایش دهند. از طرفی ممکن است آنتی‌ژن HCP حاصل ارتباط بسیار بالایی با فرایند تولید یک محصول خاص داشته باشد؛ بنابراین آنتی‌ژن HCP ممکن است برای یک فرایند ویژه تهیه شود. به‌طوری‌که پروسه کشت سلولی جهت تولید HCP مشابه پروسه تولید محصول باشد. از معایب این روش آن است که استفاده از معرف‌ها معمولاً به یک محصول (چند محصول) یا فرایند محدود می‌شود.

پس از اتمام ران سلول پوچ، آنتی‌ژن HCP را می‌توان از لیزات سلولی، مایع کشت سلولی (CCF) غلیظ یا مخلوطی از هر دو تهیه کرد. هنگام تهیه آنتی‌ژن از CCF ممکن است به سلول‌ها اجازه دهند تا لیز شوند و HCP را در CCF آزاد کنند و در نتیجه طیف گسترده‌تری از HCP را ایجاد کنند. برای تهیه ایمونوژن از لیزات سلولی، سلول‌ها را از طریق سانتریفیوژ برداشت کرده و شستشو می‌دهند. سپس سلول‌ها را با استفاده از چرخه‌های مکرر انجماد/ ذوب یا هموژن سازی با فشار بالا لیز می‌کنند.

آماده‌سازی آنتی‌ژن HCP شرایط معمولاً طوری انتخاب می‌شوند که مشابه فرایند تولید باشند. به‌عنوان‌مثال برای تهیه ایمونوژن از CCF، سلول‌ها و دبری‌ها از طریق سانتریفیوژ حذف می‌شوند. سپس CCF اولترافیلتراسیون/دیافیلتراسیون می‌گردد. سپس بافر تعویض می‌گردد (از PBS به HEPES) و CCF تغلیظ می‌گردد. در نهایت باید برای فیلتراسیون cut-off تعیین گردد تا هدررفت HCP را به حداقل رساند (برای مثال 10 کیلودالتون یا کمتر).

                                                             تصویر 1. خالص‌سازی محصول موردنظر از HCPهای تولید شده در طول فرایند تولید

آماده‌سازی آنتی‌ژن HCP از سلول‌های باکتریایی:

از سلول‌های پروکاریوتی نیز می‌توان برای تولید آنتی‌ژن‌های HCP استفاده کرد. بااین‌حال برخی از چالش‌های منحصربه‌فرد باید در نظر گرفته شود. به طور خاص، فرایندهای تولید بیشتری برای سیستم بیان باکتریایی وجود دارد. مانند آنهایی که رسوبات پروتئینی غلیظ را با نام اجسام انکوژن تولید می‌کنند که می‌توانند 95 درصد از کل پروتئین سلول را نشان دهد. ناخالصی‌های HCP همچنین در اجسام انکوژن حضور دارند از جمله پروتئین‌های غشا باکتریایی، پروتئین‌های زیرواحد ریبوزومی، پروتئین‌های سیتوپلاسمی مانند پروتئین‌های شوک حرارتی کوچک یا چاپرون‌ها. تشکیل اجسام انکوژن در سویه تولیدی، آماده‌سازی HCP در فرایند تخمیر سلول پوچ را دشوارتر می‌کند. ازآنجاکه هیچ رویکرد آشکاری برای غلبه بر این محدودیت‌ها وجود ندارد در عمل آنتی‌ژن HCP باکتریایی معمولاً از لیزات سلول‌های شسته شده با استفاده از تخمیر سلول‌های پوچ تولید می‌شوند.

ازآنجایی‌که بیشتر حیوانات در معرض آنتی‌ژن‌های باکتریایی قرار گرفته‌اند، ممکن است از قبل آنتی‌بادی‌هایی علیه بسیاری از پروتئین‌های سلولی باکتریایی داشته باشند؛ بنابراین باید پاسخ‌های آنتی‌بادی قبلی موجود را مشخص کرد و در صورت لزوم از حیوانات خاص فاقد پاتوژن (SPF) استفاده کرد. وجود سطوح قابل‌توجهی از آنتی‌بادی‌های ضد HCP از قبل ممکن است آنالیز پاسخ‌های آنتی‌بادی را مخدوش کند؛ بنابراین غربالگری سرم‌های حیوانات قبل از ایمونیزاسیون جهت تعیین آنتی‌بادی‌های از پیش موجود بسیار حائز اهمیت است. سلول‌های باکتریایی پوچ ترانسفورم شده با وکتور، حاوی ژن‌های چاپرون است که ممکن است در سطح بالایی تولید شوند (به‌عنوان‌مثال 5 درصد از کل پروتئین‌های HCP). بیان بالای یک ناخالصی HCP خاص سبب توسعه سنجش‌های تک آنالیتی برای تعیین یک ناخالصی مشخص گردیده است.

                                                                                  تصویر 2. آماده‌سازی HCP با استفاده از سلول باکتریایی