شرکت دانش بنیان هوراطب فارمد

08 اسفند معرفی سیستم بیان مبتنی بر رده سلولی حشرات

تولید پروتئین‌های نوترکیب در سلول های حشرات با باکولوویروس[1]، یک زمینه نوظهور در بیوتکنولوژی است که سابقه ای طولانی داشته و به اواسط دهه 1980 باز می‌گردد. استفاده از کشت سلولی حشرات برای بیان پروتئین هترولوگ به طور پیوسته در طی چندین دهه افزایش یافته است. یکی از تفاوت‌های عمده در تولید پروتئین بین سلول‌های حشرات و پستانداران، سنتز پروتئین های N-گلیکوزیله است. در سلول‌های حشرات، N-گلیکان‌ها ساختارهای نسبتاً ساده و کوتاهی دارند، معمولاً دارای محتوای مانوز بالا و بدون باقی‌مانده اسید سیالیک انتهایی هستند. در این نوشته به معرفی سیستم بیان مبتنی بر رده سلولی حشرات می‌پردازیم.

درحالی‌که، در سلول‌های پستانداران N-گلیکان اصلی توسط گلیکوزیل ترانسفرازها گسترش می‌یابد و ممکن است با باقیمانده اسید سیالیک خاتمه یابد تا بار منفی ایجاد کند. اسیدسیالیک انتهایی مانع از حذف گلیکوپروتئین ها توسط گیرنده‌های کربوهیدرات خاص در گونه‌های پستانداران می‌شود. در نتیجه، گلیکوپروتئین‌های نوترکیب ساخته‌شده با استفاده از سیستم باکولوویروس که فاقد اسید سیالیک N ترمینال هستند نمی‌توانند برای مدت طولانی در پستانداران باقی بمانند.

فناوری سیستم بیان مبتنی بر سلول حشرات مزایای بیولوژیکی منحصربه‌فردی نسبت به سیستم‌های بیان پروتئین باکتریایی، مخمری یا پستانداران دارد. رشد سلول‌های حشرات برای ساخت پروتئین نوترکیب آسان است. این سلول‌ها می‌توانند در محیط های ساده تر از سلول‌های پستانداران بدون نیاز به مواد مغذی پیچیده رشد کنند.

سلول‌های حشرات همچنین با استفاده از پروموترهای ویروسی قادر به بیان همزمان حداکثر چهار ژن در یک زمان هستند که آنها را قادر می‌سازد تا سطوح بیان بالایی در مقایسه با سایر سلول‌ها داشته باشند. از طرفی این سلول‌ها توانایی تغییرات پس از ترجمه مشابه با سلول‌های پستانداران را دارند. سلول‌های حشرات همچنین ظرفیت بالایی برای ژنوم‌های بزرگ دارند. در نتیجه قادر به بیان پروتئین‌هایی با وزن مولکولی بالا می‌باشند.

این سلول‌ها برای بیان پروتئین‌های مضر برای سلول‌های پستانداران (مانند توکسین‌ها) کینازها، پروتئین‌های داخل سلولی و پروتئین‌های غشایی نیز مناسب هستند و به‌دلیل اندازه کوچک و منظم قادر به ایجاد تک‌لایه سلولی و پلاک‌ها می‌باشند.

سیستم بیان مبتنی بر سلول حشرات

بااین‌حال، سیستم ناقل بیان باکولوویروس (BEVS[2]) هنوز برای تولید پروتئین‌های ترشحی بهینه نیست، زیرا عفونت ویروسی بر مسیر ترشحی سلول‌های میزبان تأثیر منفی می‌گذارد و عملکرد و کیفیت پروتئین را مختل می‌کند، به ویژه هنگامی که از پروموترهای بسیار فعال اما دیررس polH یا p10 استفاده می‌شود. این مسئله برای تولید آنتی‌بادی‌ها حیاتی است. به همین دلیل تاکنون تلاش‌های کمی برای تولید آنتی‌بادی‌ها توسط BEVS انجام شده است، زیرا بازده حاصله نسبتاً پایین بوده است.

پرکاربردترین سلول‌های حشرات، رده‌های سلولی Sf2، Sf9، Sf21 و High Five هستند که از میان آنها رده سلولی Sf9 بیشترین استفاده را داشته است. سلول Sf9 از بافت تخمدان کرم Spodoptera frugiperda  منشأ گرفته است. این سلول‌ها دارای مراحل محدودکننده سرعت در پردازش و ترشح پس از ترجمه پروتئین‌های خاص هستند. همچنین بسیاری از تغییرات پس از ترجمه شناخته شده از سلول‌های پستانداران را انجام می‌دهند.

اگرچه سلول‌های Sf9 پرمصرف‌ترین رده سلولی هستند، با این وجود سلول‌های High Five به یکی از متداول‌ترین رده‌های سلولی مورد استفاده برای بیان پروتئین نوترکیب با استفاده از باکولوویروس یا ترانسفکشن تبدیل شده‌اند و در تعدادی از موارد نشان داده شده است که پروتئین نوترکیب را به میزان بیشتر و با کارایی بالاتر نسبت به سایر رده‌های سلولی حشرات مانند سلول‌های Sf9 بیان می‌کنند. High Five (BTI-Tn-5B1-4) یک رده سلولی حشره‌ای است که از سلول‌های تخمدان Trichoplusia ni منشأ می‌گیرد. یکی از تفاوت‌های اساسی بین رده سلولی Sf9 و رده سلولی High Five در مرحله گلیکوزیلاسیون می‌باشد.

جهش موجود در مکان‌های N-گلیکوزیلاسیون، به طور بالقوه اجازه می‌دهد پروتئین در سلول‌های High Five با بازده بالا تولید شود و درعین‌حال اختصاصیت بالایی را در هنگام استفاده در یک روش تشخیصی حفظ کند. همچنین سلول High Five  از نظر متابولیسم نیز با سلول Sf9 تفاوت دارد. سلول High Five در مقایسه با سلول Sf9 میزان اکسیژن بیشتری مصرف می‌کند و در محیط کشت آن میزان بیشتری آمونیاک و لاکتات تجمع می‌کند.

سلول‌های High Five دارای مزایایی نسبت به سایر سیستم های بیان می‌باشند. سلول‌های High Five را می توان در غیاب سرم و در حالت سوسپانسیون کشت داد. از طرفی سلول‌های High Five میکروRNA های فراوانی (miRNAs ،siRNA  و piRNAs) تولید می کنند که آنها را برای مطالعه این نوع RNA ها مناسب می کند. کشت سلول‌های High Five نیازی به دستگاه هوادهی CO₂ ندارد که این امر اجرای این سیستم بیان را در مقایسه با سیستم بیان پستانداران ساده می‌کند.

همچنین سیستم بیان سلولی High Five امکان دسترسی به پروتئین‌های هدف دشوار را فراهم می‌سازد. سیستم بیانی High Five مبتنی بر پلاسمید، بازده پروتئینی بالاتری را برای پروتئین‌های ترشحی نشان داده است. مطالعات نشان داده‌اند آنتی‌بادی‌ها تولید شده در سلول‌های High Five کمتر مستعد تجمع هستند که این امر احتمالاً به دلیل الگوی گلیکوزیلاسیون ساده تر و همگن تر آنها است. در نتیجه سیستم سلول‌های High Five برای تولید آنتی‌بادی‌های تشخیصی پایدار با عملکرد و قابلیت لیوفیلیزاسیون بالاتر، مناسب تر می‌باشد. بیشتر آنتی‌بادی‌های مونوکلونال در سیستم‌های بیان پستانداران تولید می‌شوند.

راه‌اندازی یک سیستم تولید بهینه با یک کلون سلولی بهینه، زمان و هزینه زیادی دارد. برای آنتی‌بادی‌ها تشخیصی این امر ضروری نیست. بنابراین تولید سریع و گذرا مبتنی بر پلاسمید روش انتخابی برای تولید مقادیری از آنتی‌بادی‌ها در مقیاس تحقیقاتی است.

علاوه بر این، آنتی‌بادی‌های تشخیصی نیازی به گلیکوزیلاسیون پستانداران ندارند، زیرا نیاز به تعامل با سیستم ایمنی بدن انسان ندارند و امکان استفاده از سیستم‌های بیان جایگزین را فراهم می‌کنند؛ بنابراین، سلول‌های حشره به‌دلیل سهولت کشت (در دمای 27 درجه سانتی‌گراد بدون نیاز به CO₂)، تحمل بالاتر در برابر اسمولالیته محیط، غلظت محصول جانبی و محیط‌های ارزان‌تر یک جایگزین ایده‌آل برای کاهش تلاش‌ها و هزینه‌ها هستند.

اخیراً، تولید مبتنی بر پلاسمید در سلول‌های حشرات بدون استفاده از باکولوویروس گزارش شده است. بدون عفونت باکولوویروسی، سلول‌های میزبان یکپارچگی مسیر ترشحی اصلی خود، رشد طبیعی سلولی و زنده ماندن بالا را حفظ می‌کنند و در نتیجه پروتئین ترشح شده با کیفیت بالاتری را تولید می‌کنند.

[1] Baculovirus

[2] Baculovirus expression vector system